如何制作永久植物玻片标本

如何制作永久植物玻片标本
如何制作永久植物玻片标本

如何制作永久植物玻片标本
石蜡切片（paraffin section） 组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法.石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构,也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法,而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中.教学中,光镜下观察切片标本多数是石蜡切片法制备的.活的细胞或组织多为无色透明,各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差,在一般光镜下不易清楚区别出；组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败,失去原有正常结构,因此,组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡,而能清晰辨认其形态结构.
石蜡切片制作基本技术 石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤.一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日,但标本可以长期保存使用,为永久性显微玻片标本.
1.取材 应根据要求选取材料来源及部位.例如植物细胞有丝分裂多选取洋葱根尖,细胞分裂快又便于切取；猪的肝小叶边界清晰明确；耳蜗以豚鼠的内耳易于定位和剥离.材料必须新鲜,搁置时间过久则产生蛋白质分解变性,导致细胞自溶及细菌的滋生,而不能反映组织活体时的形态结构.
2.固定 用适当的化学药液——固定液浸渍切成小块的新鲜材料,迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化,尽可能保持其活体时的结构.固定能使组织硬化,有利于切片的进行,而且也有媒浸作用,有利于组织着色.固定液的种类很多,其对组织的硬化收缩程度以及组织内蛋白质、脂肪、糖类等物质的作用各不相同.例如纯酒精可固定肝糖而能溶解脂肪,甲醛能固定一般组织,但溶解肝糖和色素.固定液可分为单一固定液及混合固定液.前者有甲醛（蚁醛、福尔马林）、酒精、醋酸或冰醋酸、升汞、锇酸（四氧化锇）、重铬酸钾及苦味酸等,单一固定液不能固定细胞中的所有成分；混合固定液可以互补不足,常用的混合固定液有Bouin氏液、Zenker氏液、FAA液、Carnoy氏液、SuSa液（配方见有关技术书籍）.因此,应根据所要显示的内容来选择适宜的固定液.10％福尔马林（4％甲醛）或10％磷酸缓冲福尔马林是病理切片常规使用的固定液,不仅适用于常规HE（苏木精-伊红）染色,还可以用于组织学有关的其他技术的切片染色.固定液的用量通常为材料块的20倍左右,固定时间则根据材料块的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定,可以从1小时至数天,通常为数小时至24小时.
3.洗涤与脱水 固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀,否则会影响以后的染色效果.多数用流水冲洗；使用含有苦味酸的固定液固定的则需用酒精多次浸洗；如果组织经酒精或酒精混合液固定,则不必洗涤,可直接进行脱水.固定后或洗涤后的组织内充满水分,如不除去水分就无法进行以后的透明、浸蜡与包埋,因为透明剂多数是苯类,苯类和石蜡均不能与水相融合,水分不脱尽,苯类不能浸入.酒精为常用脱水剂,它既能与水相混合,又能与透明剂相混,为了减少组织材料的急剧收缩,应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行,通常从30％或50％酒精开始,经70％、85％、95％直至纯酒精（无水乙醇）,每次时间为1～数小时,如不能及时进行各级脱水,材料可以放在70％酒精中保存,因高浓度酒精易使组织收缩硬化,不宜处理过久.正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧陆环等也可做脱水剂.
4.透明 纯酒精不能与石蜡相溶,还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液,替换出组织内的酒精.材料块在这类媒浸液中浸渍,出现透明状态,此液即称透明剂,透明剂浸渍过程称透明.常用的透明剂有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等,各种透明剂均是石蜡的溶剂.通常组织先经纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1～2小时,再转入纯透明剂中浸渍.透明剂的浸渍时间则要根据组织材料块大小及属于囊腔抑或实质器官而定.如果透明时间过短,则透明不彻底,石蜡难于浸入组织；透明时间过长,则组织硬化变脆,就不易切出完整切片,最长为数小时.
5.浸蜡与包埋 用石蜡取代透明剂,使石蜡浸入组织而起支持作用.通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1～2小时,再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右,浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行,以利石蜡浸入组织内.浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中（摆好在蜡中的位置）,待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却,即做成含有组织块的蜡块.容器可用光亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框盒.如果包埋的组织块数量多,应进行编号,以免差错.石蜡熔化后应在蜡箱内过滤后使用,以免因含杂质而影响切片质量,且可能损伤切片刀.通常石蜡采用熔点为56～58℃或60～62℃两种,可根据季节及操作环境温度来选用.
6.切片 包埋好的蜡块用刀片修成规整的方形或长方形,以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上,夹在轮转式切片机的蜡块钳内,使蜡块切面与切片刀刃平行,旋紧.切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量,可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度.通常切片厚度为4～7微米,切出一片接一片的蜡带,用毛笔轻托轻放在纸上.
7.贴片与烤片 用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上,以免在以后的脱蜡、水化及染色等步骤中二者滑脱开.粘附剂是蛋白甘油.首先在洁净的载玻片上涂抹薄层蛋白甘油,再将一定长度蜡带（连续切片）或用刀片断开成单个蜡片于温水（45℃左右）中展平后,捞至玻片上铺正,或直接滴两滴蒸馏水于载玻片上,再把蜡片放于水滴上,略加温使蜡片铺展,最后用滤纸吸除多余水分,将载玻片放入45℃温箱中干燥,也可在37℃温箱中干燥,但需适当延长时间.
8.切片脱蜡及水化 干燥后的切片需脱蜡及水化才能在水溶性染液中进行染色.用二甲苯脱蜡,再逐级经纯酒精及梯度酒精直至蒸馏水.如果染料配制于酒精中,则将切片移至与酒精近似浓度时,即可染色.
9.染色 染色的目的是使细胞组织内的不同结构呈现不同的颜色以便于观察.未经染色的细胞组织其折光率相似,不易辨认.经染色可显示细胞内不同的细胞器及内含物以及不同类型的细胞组织.染色剂种类繁多,应根据观察要求及研究内容采用不同的染色剂及染色方法,还要注意选用适宜的固定剂才能取得满意的结果.经典的苏木精（Hematoxylin）和伊红（曙红,Eosin）染色法是组织学标本及病理切片标本的常规染色,简称HE染色.经HE染色后,细胞核被苏木精染成紫蓝色,多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色.由于苏木精是带阳离子的染料,染液呈碱性,核内染色质及胞质内核糖体等物质对这种染料有亲和性,称嗜碱性；而带阴离子的染料伊红配制的染液呈酸性,对这种染料的亲和性,称嗜酸性.有时不同的组织结构还需要用特殊的染料及染色方法加以显示,称特殊染色.有些细胞组织经硝酸银浸润后,可使溶液中银离子还原成金属银或银粒附着在细胞组织上,呈棕黑色,这种性质称亲银性,而有些细胞组织本身不能使硝酸银的银离子还原成金属银,还需加还原剂才能将银离子还原,称嗜银性.
10.切片脱水、透明和封片 染色后的切片尚不能在显微镜下观察,需经梯度酒精脱水,在95％及纯酒精中的时间可适当加长以保证脱水彻底；如染液为酒精配制,则应缩短在酒精中的时间,以免脱色.二甲苯透明后,迅速擦去材料周围多余液体,滴加适量（1～2滴）中性树胶,再将洁净盖玻片倾斜放下,以免出现气泡,封片后即制成永久性玻片标本,在光镜下可长期反复观察.注意有些染料需特定厂家生产的产品.根据各种染色方法、组织类别及切片厚度,掌握适宜的染色时间,才能达到较好的染色效果.
石蜡制片程序及环节繁多,需数日才能完成1个周期,但切片可长期保存,供教学、科研及病理诊断及复察,并可利用蜡块作其他项目的回顾性研究.病理常规制片过程中已简化了一些细的环节或缩短了部分处理时间以适应临床需要（可缩短至2天）.虽然冰冻切片大大快于石蜡切片,但所显示的形态结构却不如前者,因此病理医生最后还需要根据石蜡切片作出准确诊断.近些年来,在病理常规制片过程中采用了微波技术,从而大大缩短了制片过程,而且对形态结构并没有影响.微波是一种波长很短、频率却很高的高频电磁波〔波长为1米 ～1毫米,频率为300兆赫（MHz）～300千兆赫（GHz）〕.组织经微波辐射后加速组织内部分子的高速运动,以使液体的运输加快,增加弥散、渗透和交换效率,从而加速组织的固定、脱水、透明、包埋和染色各个环节.例如常规福尔马林固定需数小时～1天,而且能引起组织收缩及某些抗原成分不同程度的受到破坏,微波固定仅需1～2分钟,且可减少抗原的丢失和损害.选择适当的档次（功率）、辐射时间和温度是极为重要的.目前微波技术的应用在国内尚处于起步阶段,许多技术应用环节尚需进一步摸索.