求做western blot时提取贴壁细胞总蛋白详细的protocol另外,怎么看到有些protocol上没有煮蛋白这一步呢?是放在微波炉里加热就可以么?新手提的问题有些二~

求做western blot时提取贴壁细胞总蛋白详细的protocol另外,怎么看到有些protocol上没有煮蛋白这一步呢?是放在微波炉里加热就可以么?新手提的问题有些二~
求做western blot时提取贴壁细胞总蛋白详细的protocol
另外,怎么看到有些protocol上没有煮蛋白这一步呢?是放在微波炉里加热就可以么?新手提的问题有些二~

求做western blot时提取贴壁细胞总蛋白详细的protocol另外,怎么看到有些protocol上没有煮蛋白这一步呢?是放在微波炉里加热就可以么?新手提的问题有些二~
以6孔板的一个孔为例,先把培养液吸出,加入200ul的细胞裂解液,摇床摇15分钟,加loading buffer冰上放置5分钟,用细胞刮把皿底刮几次,然后全部吸出放到离心管里,95°水浴或者金属浴煮10分钟.
每个人的方法都不太一样吧,有的会在收样之后离心去沉淀,有的会再超声几分钟,有的直接拿loading buffer当裂解液用,个人觉得这些差别都不会影响你实验结果.
不过煮肯定是必须的,不然没法保存

用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度后，－80℃冰箱保存待用。参考资料：丁香园 你说的是蛋白的提取与制备吧？组织的化就匀浆，细胞的话就裂解细胞然后用

我个人经验，也以六孔板为例：
1、移除旧培养液
2、每孔加PBS1ml，漂洗1到2次
3、每孔加蛋白裂解液100ul（蛋白裂解液不易加多，多了会稀释蛋白浓度）
4、然后用细胞刮棒来回刮除细胞，用枪头吸出液体至干净的EP管（操作最好在冰上，尽量吸干净）
5、短暂振荡一下，置冰静置15到30分钟
6、离心：12000转，20min。离心结束后你会看到管底...

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我个人经验，也以六孔板为例：
1、移除旧培养液
2、每孔加PBS1ml，漂洗1到2次
3、每孔加蛋白裂解液100ul（蛋白裂解液不易加多，多了会稀释蛋白浓度）
4、然后用细胞刮棒来回刮除细胞，用枪头吸出液体至干净的EP管（操作最好在冰上，尽量吸干净）
5、短暂振荡一下，置冰静置15到30分钟
6、离心：12000转，20min。离心结束后你会看到管底有沉淀
7、将上清液移至新的EP管，注意不要碰到沉淀，取10ul留作后来蛋白定量，剩下的记下转移量
8、我们实验室用5X上样缓冲液按1:4的体积加入，比如你上面的转移量是80微升，那么就加入5X上样缓冲液20微升。
9、短暂振荡，离心
10、煮蛋白，就是沸水5分钟
11、最后-80度保存就可以了
我自己就这样，呵呵，其实很简单

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一步法动物细胞活性蛋白提取试剂盒
产品编号：BSP022
产品简介：
动物细胞活性蛋白提取试剂盒可以高效，快速地从培养的悬浮或贴壁的动物细胞中提取有活性的细胞质和核蛋白质，该试剂采用一种温和的可以通过透析去除的非离子型去污试剂，该提取方法高于传统的反复冻溶法和超声法，已经在培养的COS-7, NIH3T3, H...

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一步法动物细胞活性蛋白提取试剂盒
产品编号：BSP022
产品简介：
动物细胞活性蛋白提取试剂盒可以高效，快速地从培养的悬浮或贴壁的动物细胞中提取有活性的细胞质和核蛋白质，该试剂采用一种温和的可以通过透析去除的非离子型去污试剂，该提取方法高于传统的反复冻溶法和超声法，已经在培养的COS-7, NIH3T3, Hepa 1-6, 293, CHO 细胞中得到验证，提取的蛋白质可以最大限度的保持活性，可以用于1D，2D电泳，免疫共沉淀，Pull Down,EMSA，报告基因分析(Luciferase, β-galactosidase, Acetyltransferase等), 蛋白质激酶分析 (PKA, PKC, Tyrosine Kinase等), 酶免分析 (Western blot, ELISA, RIA) 等。由抽提试剂，蛋白酶抑制剂，DTT和PMSF组成，本试剂盒可以使用20次
产品特点
1．可以直接裂解贴壁培养的细胞或经过洗涤和收集的刮下的和悬浮培养的细胞。
2．对于贴壁培养的细胞，蛋白提取效率与反复冻溶法相同；对于刮下的和悬浮培养的细胞，蛋白提取效率高于反复冻溶法和超声破碎法，整个实验过程只需要20分钟左右。
3．提取的蛋白质可以透析去除离子和去污试剂，或将缓冲液替换为所需要的目的蛋白质的合适缓冲液。
4．提取的活性蛋白质保持非变性状态，可以直接用于1D，2D电泳，免疫共沉淀，Pull down,EMSA，蛋白纯化，酶活分析等实验。
5．可以维持报告基因酶(Luciferase, β-galactosidase, Acetyltransferase等)，蛋白质激酶(PKA, PKC, Tyrosine Kinase等) 的活性。

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